抗肿瘤有效成分藤黄酸季铵化壳聚糖纳米粒
的制备与表征
曲国威，张灿
（中国药科大学新药研究中心，南京 210009）
摘要：研究藤黄酸季铵化壳聚糖纳米粒的主要药剂学性质。以天然聚合物壳聚糖为原料采用
两步季铵化合成了季铵化壳聚糖(TMC)，通过混合溶剂法制备了藤黄酸(gambogic acid,
GA)TMC 纳米粒(nanoparticles，NPs)，用FT-IR 和1HNMR 表征TMC 结构并计算出季铵化
程度(DQ)并用FT-IR、1HNMR 及透射电镜(TEM)表征载药纳米粒结构。NPs 的载药量为
(23.28±0.98)%，包封产率为(74.94±4.00)%，粒径为(98.24±3.5) nm。TEM 观察载药纳米粒的
形态为 100 nm 左右的球体。FT-IR 和1HNMR 表征证实GA 被包埋在纳米粒的内部。用混
合溶剂法可以成功制备得到藤黄酸季铵化壳聚糖纳米粒。
关键词：纳米粒；藤黄酸；季铵化壳聚糖
中图分类号：R944.9 文献标志码：A
Preparation and characterization of N-trimethyl chitosan
nanoparticles containing anti-tumor active component
gambogic acid
Qu Guowei, Zhang Can
(Center for Drug Discovery, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
Abstract: N-trimethyl chitosan (TMC) has been synthesized via two-step method using natural
chitosan and characterized by FT-IR and 1HNMR, the degree of quaternization (DQ) was also obtained
from the analysis of 1HNMR. TMC Nanoparticles (NPs) containing gambogic acid (GA) was prepared
using mixed solvent method, the loading efficiency, entrapping efficiency and size of the NPs were
(23.28±0.98)%, (74.94±4.00)% and (98.24±3.5) nm respectively. The structure of NPs containing GA
was verified by FT-IR and 1HNMR, it’s demonstrated that GA was encapsuled into the inner core of
the NPs.
Key words: nanoparticles; gambogic acid; N-trimethyl chitosan
0 引言
藤黄酸（gambogic acid, GA，图1）为植物藤黄的主要成分，具有良好的抗肿瘤作用，
但其水溶性较差，限制了其临床应用。文献报道藤黄酸与L-精氨酸形成盐、加入聚氧乙烯
蓖麻油(cremophor EL)或进行结构改造达到增溶的目的[1]。
纳米粒具有稳定、载药量高的特点， 粒径较小， 可以避免被网状内皮系统
(reticuloendothelial system，RES)细胞摄取实现在血液中长循环，并通过肿瘤部位通透性增强
与滞留(enhanced permeability and retention，EPR)效应最终被动靶向到肿瘤部位[2-3]。
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20090096110005)
作者简介：曲国威(1983－ )，男，博士研究生，主要研究方向：药用高分子材料
通信联系人：张灿，教授，主要研究方向：药用高分子材料及药物新剂型，zhangcancpu@yahoo.com.cn
 图1　藤黄酸化学结构式
Fig. 1　The chemical structure of gambogic acid
水溶性季铵化壳聚糖(TMC)是天然聚合物壳聚糖的衍生化产物，可作为药物和基因载体
[4]。由于TMC 具有正电性，GA 结构中具有带负电的羧基，因此笔者设想可将TMC 与GA
通过电性作用形成水溶性纳米粒[4-5]，增加藤黄酸的水溶性，提高GA 在化学治疗中的有效
性与安全性，拓展了其临床应用。
笔者以壳聚糖为原料采用两步季铵化合成季铵化壳聚糖(TMC)，用FT-IR 和1HNMR 表
征其结构并计算季铵化程度(DQ)。通过混合溶剂法制备藤黄酸(GA)TMC 纳米粒，采用HPLC
测定载药量与包封产率。使用动态光散射(DLS)测定载药纳米粒的粒径。用透射电镜(TEM)
观察载药纳米粒的形态。并通过FT-IR 和1HNMR 表征载药纳米粒。
1 实验部分
1.1 仪器
微孔滤膜（上海新亚净化器件厂）；透析袋（截留分子量1 万，Sigma-Aldrich 公司）；
TGL-16 型离心机（郑州长城科工贸有限公司）；Agilent 1100 色谱仪（美国Agilent 公司）；
Zetasizer 3000HSA 粒径电位仪（英国Malvern 仪器公司）；JEM-200CX 型透射电镜（日本
JEOL 公司）；Impact 410 型红外光谱仪（美国Nicolet 公司）；Avace AV-300, AV-500 核磁
共振仪（瑞士Bruker 公司）。
1.2 药品与试剂
藤黄酸（GA，自制，纯度99.7％）；壳聚糖（脱乙酰度90%，黏均分子量为65 000，
南通双林生物制品有限公司）；其他试剂为市售分析纯。
R2:NH2,NHCOCH3,N(CH3)3,N(CH3)2,NHCH3
O
OH
O
HO
R1
O
H
n
R1 :NH2,NHCOCH3
1-methyl-2-pyrrolidinone
kalium iodidum
sodium hydroxide solution
chitosan TMC
O
OH
O
HO
R2
O
H
n
图2　TMC 合成路线
Fig. 2　Synthesis of TMC
1.3 季铵化壳聚糖的合成与表征
采用二步合成法[6]，合成路线见图2。取壳聚糖原料(70 k，12 g)，加入1-甲基-2-吡咯烷
酮240 mL，碘甲烷70 mL，碘化钠31.2 g 和15 %氢氧化钠溶液66 mL，搅拌，在60 ℃水浴
中回流1 h。反应完毕，将反应产物倾入400 mL 乙醇和300 mL 乙醚的混和溶剂中，沉淀，
 离心，沉淀物用乙醚洗涤2 次，然后再加入1-甲基-2-吡咯烷酮160 mL，加热到60 ℃，除
去乙醚， 冷却到室温后加入碘甲烷70 mL，碘化钠31.2 g 和15 %氢氧化钠溶液66 mL，快
速搅拌，60 ℃水浴加热30 min，再加入碘甲烷12 mL，2.4 gNaOH，继续反应1 h，反应结
束后，沉淀，离心，沉淀用乙醚洗涤2 次，将产物倒入10 % NaCl 240 mL 中交换I－，去离
子水透析3 d，冻干。得淡黄色絮状的水溶性TMC。
1.4 藤黄酸季铵化壳聚糖纳米粒的制备
采用混合溶剂法制备载药纳米粒。14 mg GA 与10 mg TMC 分别溶于0.56 mL 二甲亚砜
和1.67 mL 蒸馏水中，两溶液在磁力搅拌下混合装入透析袋，封口后在蒸馏水中透析，所得
溶液经3 000 r/min 离心后过0.45 μm 微孔滤膜。所得样品在4 ℃下避光保存。
1.5 载药纳米粒中藤黄酸含量测定
液相条件：色谱柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，Dikma Tecnologies)；流动相V
甲醇∶V 水＝93∶7，以磷酸调pH 到3.5；流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 μL；检测波
长360 nm。
标准曲线的建立：将藤黄酸标准品用色谱甲醇溶解制成1.084 mg/mL 的储备液，分别吸
取上述储备液0.2、0.4、0.6 和0.8 mL 于100 mL 容量瓶中，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 于
10 mL 容量瓶中，以流动相定容，配成2.168、4.336、6.504、8.672、10.84、21.68、43.36、
65.04 和86.72 μg/mL 的标准溶液，在上述的色谱条件下测定GA 含量，记录色谱峰面积A，
绘制标准曲线。
精密度实验：分别配制质量浓度为2.1、50.3 和100.2 μg/mL 的GA 标准品溶液，在上述
液相条件下进样20 μL，根据标准曲线得出药物浓度，计算日间与日内差异。载药量与包封
产率的计算公式如下：
(%)= (mg) 100 %
(mg)+ ( )
3
mg
× 被包裹的药物的量
载药量
被包裹的药物的量包裹药物所用载体的量， (1)
(%)= (mg) 100 %
(mg)
× 被包裹的药物的量
包封产率
投药量。 (2)
1.6 载药纳米粒的表征与物理性质
FT-IR：将GA 原药、TMC、GA 与TMC 的物理混合物以及载药纳米粒冻干纷经KBr
压片，测得红外吸收数据。
1HNMR：将GA 原药溶于CDCl3，TMC 溶于D2O，载药纳米粒冻干粉分别溶于CDCl3
和D2O，使用Avace AV-300 核磁仪测定。
粒径、电位与形态：纳米粒溶液经过0.45 μm 微孔滤膜后，在25 ℃， 633 nm 的He-Ne
光下，使用Zetasizer 3000H 粒径测定仪测定载药纳米粒的粒径。为了观察其表面形态，将
过0.22 μm 膜的纳米粒溶液滴加到铜载网上，干燥后使用透射电镜JEM-200CX 在200 kV 下
观察。
2 结果与讨论
2.1 季铵化壳聚糖的结构分析
 壳聚糖的红外谱图（图3，A）中3 200~3 500 cm－1 间宽峰及2 918 cm－1，1 416 cm－1
和1 338 cm－1 处弱峰为N—H 伸缩振动O—H 伸缩振动。TMC 的红外谱图（图3，B）中2 925
cm－1，2 845 cm－1，1 475 cm－1 和1 383 cm－1 处峰强度变大证明有—CH3 引入到壳聚糖分子
结构中。
图3　壳聚糖(A)及TMC(B)的IR 图谱
Fig. 3　IR spectra of chitosan (A) and TMC (B)
TMC 的1HNMR(D2O)见图4。δ 3.3 处峰归属为N﹢(CH3)3，2.6 处峰归属为N(CH3)2，根
据文献[6]计算TMC 季铵化程度为 45.2％。
图4　TMC 的1HNMR 图谱
Fig. 4　1HNMR spectra of TMC
2.2 载药纳米粒中藤黄酸含量测定
标准曲线：ρ=0.0328A+0.2597，(r2=0.999)，质量浓度范围2~100 μg/mL。实验中取0.1 mL
样品液于5 mL 容量瓶中，用流动相定容后进样，根据标准曲线计算出样品液中GA 的浓度。
精密度实验：标准曲线的日间、日内RSD 均小于10%，精密度良好。
按包封产率，载药量公式计算得包封产率为(74.94±4.00)% 载药量为(23.28±0.98)%。
2.3 载药纳米粒的结构与物理性质
GA 的红外谱图（图5，A）在1 736，1 690 cm－1 处有较强的峰，物理混合物（图5，B）
中1690 cm－1 处峰几乎消失，1 736 cm－1 处峰变弱，在载药纳米粒红外谱图中（图5，D）只
能观察到很弱的1 736 cm－1 峰。由红外谱图推测GA 被载体包裹进入了纳米粒核内，只有极
少量游离药物吸附在纳米粒外层，因此表现出很弱的药物特征峰。
 图5　GA (A)、TMC 与GA 的物理混合物(B)、TMC(C)及NPs (D)的IR 图谱
Fig. 5　IR spectra of GA (A), mechanical mixture of TMC and GA(B), TMC(C) and Nanoparticles(NPs) (D)
GA、TMC 以及载药纳米粒的1HNMR 谱图如图6 所示。载药纳米粒(D2O)与TMC 的
1HNMR(D2O)比较显示：两者特征峰相似，无药物特征峰，说明药物被包埋在纳米粒内部，
表面无吸附或吸附极少。载药纳米粒在CDCl3 中的谱图中显示出药物特征峰，这是因为有
机溶媒破坏了纳米粒的结构使药物泄漏，泄漏的药物溶解在CDCl3 中反映出药物特征峰，
TMC 在CDCl3 中微溶，显示出TMC 特征峰。
图6　GA (A)、NPs 在D2O 中(B)、TMC(C)及NPs 在CCl3D 中(D)的1HNMR 图谱
Fig. 6　1HNMR spectra of GA (A), nanoparticles (NPs) TMC (C), and nanoparticles (NPs) in CCl3D (D)
粒径、电位与形态：粒径对纳米药物传递系统的性质具有重要的影响。纳米粒的平均粒
径能影响其被动靶向以及所包裹药物的传递，纳米粒粒径在10~200 nm 之间能减少被网状内
皮系统(RES)摄取进入体循环的可能性，这也是纳米粒药物递送系统具有一些独特性质的结
构基础。经Zetasizer 3000HSA 测定（图7）载药纳米粒的粒径是(98.24±3.5) nm (mean±SD,
n=5)。从透射电镜照片（图8）中可以看出载药纳米粒为粒径100 nm 左右球体。电镜结果
与粒径仪测定相符。
 图7　包载GA 的NPs 的粒径分布图
Fig. 7　Diameter of GA loaded nanoparticles (NPs)
图8　包载GA 的NPs 的TEM 图
Fig. 8　GA loaded nanoparticles (NPs) in water visualized by TEM
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