DNA 损伤与肿瘤辐射敏感性#
刘强1,2，杜利清1,2，王彦1,2，王芹1,2，李进1,2，曹嘉1,2，王宏1,2，陈凤华1,2，
樊飞跃1,2**
基金项目：国家自然科学基金（30800281）；天津市自然科学基金重点项目（10JCZDJC16900，
11ZCGYSY02400）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（200800231051，20101106110046）。
作者简介：刘强，（1974-），男，副研究员，主要从事放射医学研究
通信联系人：樊飞跃，（1958-），男，研究员，主要从事放射医学研究. E-mail: faithyfan@yahoo.cn
5 （1. 中国医学科学院放射医学研究所，天津 300192；
2. 天津市分子核医学重点实验室，天津 300192）
摘要：目前在肿瘤的放射治疗中，经常发现同种肿瘤及同病理类型的不同病人其治疗效果有
很大差异，对周围正常组织的损伤程度也不同。其中一个重要的原因就是肿瘤细胞对射线的
敏感性不同。通过对ΔmtDNA4977 的研究并结合对肿瘤组织DNA 双链断裂的检测，为临床提
10 供一个经济、快捷的预测肿瘤细胞辐射敏感性的指标,有望用于临床患者个体化放疗方案的
设计和可能的疗效判定。
关键词：辐射敏感性；肿瘤；DNA 损伤；彗星分析；线粒体DNA
中图分类号：Q691
15 DNA damage and the radiosensitivity of tumor cells
Liu Qiang1,2, Du Liqing1,2, Wang Yan1,2, Wang Qin1,2, Li Jin1,2, Cao Jia1,2,
Wang Hong1,2, Chen Fenghua1,2, Fan Feiyue1,2
(1. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union
Medical College, TianJin 300192;
20 2. Tianjin Key Lab of Molecular Nuclear Medicine, TianJin 300192)
Abstract: In the clinical practice of radiotherapy for tumor, we often discover that there is so
much difference of therapeutic effects and the damage to the normal tissue around tumor among
different patients who have different tumor or the different patho-type of the same tumor. The
difference of radio-sensitivity in tumor cells is the main reason for this. Studies are effort to
25 establish sensitive and rapid methods and biomarkers to predict the radio-sensitivity of tumor cells
before the radiotherapy using the detection of the 4977bp deletion of mitochondrial DNA
(ΔmtDNA4977) and DNA double strand breaks. Physicians can make different individual plan in
their radiaotherapy for each patient according to the prediction of radio-sensitivity.
Keywords: Radiosesitivity; Tumor; DNA damage; Comet assay; Mitochondrial DNA
30
0 引言
目前，肿瘤的放射治疗仍然是临床上应用最广泛和最重要的治疗手段之一，然而各种肿
瘤甚至同种肿瘤不同病理类型、不同病人其治疗效果却有很大差异，其中一个重要的原因就
是肿瘤细胞对射线作用的敏感性不同[1]，但是目前所采用的各种肿瘤的常规放疗方案，大都
35 基于把某一类型的肿瘤患者看作是放疗反应相同的个体，而同一类型间存在的固有放射敏感
性的差异，显著地影响了肿瘤的放疗控制率。此问题在颅内肿瘤的放射治疗中尤其突出。近
年来，随着放射外科的飞速发展，为颅内肿瘤或其它良性占位性病变提供了非常有效的治疗
手段，同时，也带来了一些新问题。临床观察发现，同种病理类型的不同患者经γ刀治疗后
的反应存在较大差异，主要表现在肿瘤周边部位脑组织水肿，说明不同患者个体之间的辐射
40 敏感性不同影响到了治疗效果和副作用。
虽然许多实验室以检测生物标志来预测肿瘤的辐射敏感性, 但尚缺乏特异性。因此肿瘤
细胞的放射敏感性预测在放射生物学和肿瘤学领域中一直是研究的热点之一。对原代肿瘤细
 胞辐射敏感性的预测可以为不同患者个体提供最优化的治疗方案[2]。
目前，判断肿瘤细胞放射敏感性较可靠的依据是低剂量照射后的细胞存活率[3]（如SF2
45 或D0），但是这种方法有许多不足之处，如细胞克隆培养需要的时间较长；活检细胞体外
培养不易成功等，直接影响患者的及时治疗。因而开发快速、简便的肿瘤细胞内在放射敏感
性预测方法，对临床个体化治疗方案设计以及提高肿瘤控制率和治愈率具有重要意义，临床
的迫切需要和技术的发展，使越来越多的学者开始研究非克隆存活终点而又能反应细胞死亡
程度的敏感性预测指标，以期获得快速预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。如用染色体畸变预
50 测肿瘤细胞辐射敏感性，包括微核[4-6]、中期染色体[7-9]及早成熟染色体[10]（pcc）几个细胞
水平上的测定。在单个细胞系里，微核为可观察的损伤提供了一种便利的方法，但是微核率
与细胞辐射敏感性的关系因细胞系的不同而不同；中期染色体畸变与多数肿瘤细胞辐射敏感
性之间有明显的相关性，但目前缺乏用统一的染色体畸变类型和标准的畸变检测方法来衡量
人肿瘤细胞的辐射敏感性；虽用早熟染色体凝集法能很好的测定辐射诱导的原初染色体畸
55 变，但这种方法受非同步细胞在周期各阶段分配比例的影响，因为非同步细胞在周期各阶段
分配比例的不同会影响其辐射敏感性。因而微核、染色体畸变能否成为临床上预测人肿瘤细
胞辐射敏感性的依据，有待于进一步研究。
肿瘤细胞核内和核外DNA 对电离辐射的反应与细胞的辐射敏感性密切相关。核内DNA
断裂的检测方法很多，近年来比较流行而且简便易行的方法主要是单细胞凝胶电泳方法。而
60 对于核外DNA，近年来，国外有学者开始研究新的辐射生物终点如线粒体DNA(mtDNA)缺
失的直接检测[11,12], 以期获得快速预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。
1 线粒体DNA 片段缺失与辐射敏感性
线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是惟一的核外遗传物质。人类mtDNA 是含有
16569bp 的双链闭环分子，mtDNA 含有37 个编码基因及一段与mtDNA 复制及转录有关、
65 不编码基因的D 环区，任何突变都会累及基因组中的重要功能区域。它位于线粒体的内膜，
容易遭受到活性氧自由基侵害，同时缺乏有效的修复系统及组蛋白保护，受损伤后缺乏修复
能力，因此决定了它比核DNA 对电离辐射产生的氧化损伤更敏感，其突变率远远高于核
DNA，为核DNA 的10～20 倍[13]，而且mtDNA 易发生点突变和缺失突变。在各类突变中，
mtDNA 的缺失突变成为生物医学领域的研究热点。
70 在辐射生物学领域，对线粒体DNA 缺失的研究才刚刚起步。线粒体DNA 在细胞中的
拷贝数很高，每个细胞中约有100～1000 个 mtDNA 分子，可以很简单地分离出完整的闭
环mtDNA，使mtDNA 的研究成为可能。
mtDNA 和核DNA 一样，受到辐射后可发生DNA 双链断裂和单链断裂，可诱导DNA
的片段化和细胞凋亡。mtDNA 与细胞的辐射敏感性有密切的关系。Kubota 等[12]观察到：对
75 辐射敏感性肿瘤细胞和辐射不敏感性肿瘤细胞用γ射线照射，分别在2Gy 和10Gy 剂量点
诱导出mtDNA4977 片段缺失（ΔmtDNA4977），实验证明，无论人肿瘤细胞来源如何，根
据辐射敏感性的不同都能在相应的剂量点诱导出mtDNA4977，认为mtDNA 碱基序列中的
13446 和8469 碱基是断裂的热点，射线易使其断裂，产生ΔmtDNA4977。这表明：引起Δ
mtDNA4977 的辐射剂量水平可以反映细胞对辐射的敏感性，因此，我们可根据诱导肿瘤细
80 胞产生ΔmtDNA4977 的剂量的不同来判断肿瘤的辐射敏感性。最近还有人研究发现：辐射
可诱导ΔmtDNA4977 的特异发生，而且mtDNA4977bp 缺失率随剂量的增加而增加，有良
好的剂量-效应关系。将mtDNA4977 的缺失分析作为细胞放射敏感性预测指标具有很大的
 应用潜力。
mtDNA4977bp 缺失是电离辐射引起的最为常见的突变[14]，该缺失位于mtDNA 碱基序
85 列中的13bp 的正向重复序列，即8470-8482 和13447-13459bp 之间[15]。采用巢式PCR 技术，
扩增电离辐射诱导肿瘤细胞株mtDNA4977bp 缺失，克服了普通PCR 方法的结果受到许多
因素的影响而不稳定的缺点，提高了检测结果的可靠性[16]。γ射线照射后肿瘤细胞都发生
mtDNA4977bp 的缺失，验证电离辐射可诱导mtDNA4977bp 缺失的发生，同时也提示
mtDNA4977bp 缺失可能是辐射损伤的标志之一。Kubota[12]等的研究认为，可以根据能够诱
90 导处mtDNA4977bp 缺失的辐射剂量的大小来判断细胞的辐射敏感性。我们认为，在非定量
条件下，可以采用Kubota 等的方法来判断细胞的辐射敏感性，而在定量条件下，可以在某
特定剂量照射后，对诱导出的mtDNA4977bp 缺失进行定量分析，进而判断不同细胞的辐射
敏感性。
2 彗星分析技术与肿瘤辐射敏感性
95 肿瘤细胞受到辐射后可发生DNA 双链断裂和单链断裂，DNA 断裂与细胞的辐射敏感
性有密切的关系。细胞核中的DNA 为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA 双链以组蛋
白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA 单链断裂对核酸分子双股结构的
连续性影响不大，而且不易释放出来。电离辐射等各种外界因子诱发细胞DNA 断裂时，DNA
的超螺旋结构被破坏，在裂解液的作用下，去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋
100 白，细胞内的蛋白质和RNA 等其它成分扩散到裂解液中，而核DNA 由于分子量太大只能
留在原位，残留而形成类核。如果类核中的DNA 有断裂，断裂点将引起DNA 致密的超螺
旋结构松散，在类核外形成一个DNA 晕圈。将类核置于电场中电泳，受损的DNA 断链和
片段被释放出来，从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在荧光显微镜下，阳极方向可见
形似彗星的特征性图像，故又称“彗星试验（comet assay）”。彗星尾部即为迁移出类核的
105 DNA 片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA 损伤越严重，导
致DNA 超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA 片段越小，从而在彗星尾部出现的
DNA 断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或
荧光强度等指标，可以对DNA 的损伤程度进行定量分析。
Wada[2]等观察到：对辐射敏感性肿瘤细胞和辐射不敏感性肿瘤细胞用γ 射线照射，经
110 SCGE 分析后，发现二者存在显著差异，说明用该方法检测辐射引起DNA 损伤的严重程度
可以反映细胞对辐射的敏感性。Bacová 等也发现，肿瘤细胞DNA 损伤辐射敏感性之间有很
好的相关性[17-18]，然而，Dikomey 和Olive 等发现二者之间并没有相关性[19,20]，但是，值得
注意的是Dikomey 和Olive 等采用的方法都是检测DNA 单链断裂，而非双链断裂。国外许
多肿瘤中心的放射生物室相继开展了预测肿瘤放射敏感性方面的研究，结果表明单细胞凝胶
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