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游离DNA 一般特征及cfsDNA 的研究现状 和应用前景# 吴春林，李红钢，朱长虹** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（No.20090142110034） 作者简介：吴春林，（1979-），男，博士研究生，主要从事生殖生理和男性不育的研究。 通信联系人：李红钢，（1975-），男，副教授，主要从事生殖生理、男性不育和避孕节育的研究。 E-mail: lhgyx@hotmail.com 5 （华中科技大学同济医学院计划生育研究所，武汉 430030） 摘要：游离DNA 又称为胞外DNA，在人多种体液中被广泛研究并成为多种疾病无创诊断 和研究的新分子标记物。近年来，游离DNA 在其一般特征和生物学功能方面取得一定进展； 精浆游离DNA 的发现在男性特发性不育和生殖系统肿瘤诊断及研究方面展示出了良好应用 前景。本文结合游离DNA 一般特征、生物学功能、精浆游离DNA 的研究现状及应用前景 10 作一综述。 关键词：游离DNA；精浆游离DNA；特征；男性特发性不育；肿瘤 中图分类号：R321.1 Characteristics of cell-free DNA and research state and 15 applicable perspective of cell-free seminal DNA WU Chunlin, LI Honggang, ZHU Changhong (Family Planning Research Institute, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, WuHan 430030) Abstract: Cell-free DNA is also termed as extracellular DNA, which has been detected in many 20 kinds of human body fluids and reported as promising noninvasive biomarkers for disease diagnosis and research. Recent researches discovered some progress of cell-free DNA in the area of general characteristics and biological functions. Cell-free DNA was detected in the seminal plasma, which has proposed as promising noninvasive biomarkers for the diagnosis of male idiopathic infertility and early diagnosis, treatment monitoring, prognosis of outcome in testicular 25 germ cell tumors and prostatic cancer. This review focuses on the general characteristics and biological functions of cell-free DNA, and research state and applicable perspective of cell-free seminal DNA. Keywords: kcell-free DNA; cell-free seminal DNA; characteristic; male idiopathic infertility; cancer 30 游离DNA (cell-free DNA, cfDNA)又称为胞外DNA，广泛分布于人血浆、尿液、脑脊液、 支气管肺泡灌洗液、羊水和精浆等体液及体外细胞培养液中。目前，cfDNA 被临床广泛研 究并成为多种疾病无创诊断、疗效监测及预后评估的重要分子标志物。近来，cfDNA 存在 形式和基因组转移功能的研究取得一定进展，精浆游离DNA(cell-free seminal DNA, cfsDNA) 35 的研究提示其在男性特发性不育和生殖系统肿瘤诊断及研究方面有良好应用前景。本文综述 cfDNA 一般特征及生物学功能，并介绍cfsDNA 的研究现状及其在男性生殖系统疾病的应用 前景。 1 cfDNA 一般特征 1.1 浓度 40 cfDNA 浓度测定能确定其是否满足分子生物学技术检测要求。目前，人血浆、尿液、 脑脊液、支气管肺泡灌洗液、羊水和精浆提取的cfDNA 均能满足PCR 检测要求，并有关于 血浆[1]、尿液[2]和羊水[3]cfDNA 用于实时定量甲基化PCR（Methylight）或甲基化特异性PCR 检测的报道。体液cfDNA 浓度水平为其用于临床无创诊断和研究提供了保证。cfDNA 浓度 具有以下特点：①同一个体不同体液cfDNA 浓度有一定差异；②同一个体相同体液不同生 45 理和病理状态下cfDNA 浓度有一定差异；③不同个体相同体液相同生理或病理状态下 cfDNA 浓度有一定差异。总之，体液cfDNA 浓度受多种因素影响，与产生cfDNA 细胞种类、 细胞数量、细胞代谢与更新速度、DNA 酶活性及肝、脾、肾DNA 清除速率有关。 1.2 细胞来源和产生机制 体液中cfDNA 来源广泛，包括多种类型细胞，不同体液cfDNA 细胞来源具有一定差异 50 [4]。尽管我们已经知道多种体液cfDNA 的细胞来源，但是cfDNA 的产生机制至今仍不完全 清楚。目前，普遍认为cfDNA 有两种产生方式，包括活细胞主动释放及凋亡、坏死细胞被 动释放。Waldenstr.m 等将小鼠心肌细胞系HL-1 培养48h 后，提取其培养液中微囊泡/外来 体（Microvesicles/exosomes）的DNA，经基因芯片筛查鉴定了343 种基因DNA 序列[5]；另 外，人精浆前列腺小体的微囊泡/外来体中也检测到DNA 分子[6]。这些结果均表明细胞能主 55 动释放DNA 至胞外。产生cfDNA 另一途径为细胞凋亡和坏死。生育功能正常男性精浆、 肿瘤患者血浆等体液cfDNA 电泳条带中含典型DNA 梯形电泳图[7, 8]，与凋亡细胞DNA 电 泳图一致；并在凋亡小体中发现含DNA 的核小体[9]。这些证据表明细胞凋亡可释放DNA 至体液中。也有一些报道支持细胞坏死释放DNA 至体液中。首先，在精浆和血浆cfDNA 电泳图中，除180-800bp 小片段DNA 分子外，还含有10-21kbDNA 分子[7, 8]，这部分DNA 60 分子可来自于坏死细胞[8]；其次，分别在人Jurkat T 细胞体外和BALB/c 小鼠体内使用促细 胞凋亡或坏死药物后，细胞培养液及小鼠血浆cfDNA 浓度均增高，促肝细胞凋亡药物与坏 死药物处理的小鼠血浆cfDNA 电泳条带有明显差异，分别呈现凋亡和坏死细胞电泳图特征 [8]。 1.3 存在形式 65 DNA 酶Ⅰ和Ⅱ广泛分布于人体液中，能降解清除体液cfDNA。Lo 等对分娩后孕妇游离 胎儿DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)代谢情况进行研究，发现血浆cffDNA 在2h 内被完全 清除，平均半衰期为16.3min[10]。最近，有一课题组对972 例不同运输时间的孕妇血浆胎儿 RhD 基因进行定量检测，发现室温运输5 天及以内的标本RhD 含量无明显差异[11]。这一发 现表明cffDNA 在体外室温能稳定存在，与cffDNA 的体内清除半衰期时间有明显差异，可 70 能与cffDNA 在体内与体外微环境的DNA 清除方式不同有关。除血浆cffDNA 外，正常人 血浆及精浆体外实验也证明cfDNA 能稳定存在。Lam 等将10 例健康受试者血液在室温分别 放置0、2、6 和24h 后提取其血浆cfDNA，通过实时定量PCR 检测β-球蛋白DNA 含量， 发现β-球蛋白含量未见明显变化[12]。表明正常人血浆cfDNA 体外24h 内能够稳定存在，而 对正常人精浆研究得出相似的结论[7]。由此推测，体液游离DNA 在体外能稳定存在可能与 75 其存在形式有关。 Li 等比较0.22μm 滤膜过滤和高速离心两种不同处理方式提取的人cfsDNA 浓度差异， 发现0.22μm 滤膜过滤后提取的cfsDNA 浓度与高速离心处理后提取的cfsDNA 浓度无明显 差异[7]。提示cfsDNA 可能主要与脂类、蛋白质等大分子结合，以小于0.22μm 复合物形式 稳定存在。Bischoff 等通过微离心过滤装置回收所有可能存在形式的血浆cfDNA，并在电子 80 显微镜下观察DNA 的存在形式，发现血浆cfDNA 主要以核小体形式存在，且有部分DNA 以核小体形式存在于凋亡小体内[9]。cfDNA 不仅存在于凋亡小体，最近发现DNA 分子也存 在于前列腺小体的微囊泡/外来体中[6]。综上所述，cfDNA 主要以核小体形式存在，也能存 在凋亡小体和微囊泡/外来体中防止其被DNA 酶降解。cfDNA 的存在形式不仅解释了其稳 定存在的机制，且为cfDNA 有效收集、保存和提取提供了实验基础，便于cfDNA 应用于临 85 床无创诊断和研究。 2 cfDNA 生物学功能 自从发现体液游离mRNA 能通过外来体进行信息传递后[13]，cfDNA 在体液中的生物学 意义引起学者们的关注。2001 年,Garcia-Olmo 等将接种DHD-CAT 结肠癌细胞致瘤的大鼠血 浆与DHD 结肠癌细胞体外共培养，显示CAT 基因能被DHD 细胞摄取并整合到基因组中, 90 由此提出基因组转移假说[14]，即血浆中水平转移的肿瘤cfDNA 具有使远处器官干细胞转化 的潜能。如果这一假设成立，可推测原发病灶肿瘤细胞释放的重要致癌基因被远处器官易感 干细胞摄取后能使细胞转化，从而引起肿瘤转移。有一些证据支持这一设想。首先，正常人 前列腺小体的DNA及结肠直肠癌患者血浆cfDNA能分别被精子和小鼠NIH-3T3 细胞摄取[15, 16]；其次，最近实验显示，结肠直肠癌患者血浆与NIH-3T3 细胞体外共培养，NIH-3T3 细胞 95 中检测到人突变K-ras、P53 和β-球蛋白DNA 序列；而且，将转化了人特异DNA 的NIH-3T3 细胞注射到伴有免疫缺陷的严重非肥胖性糖尿病小鼠体内可形成肿瘤[16]。血浆cfDNA 中致 癌基因是否为引起NIH-3T3 转化致瘤的关键因素还需进一步研究[16]。另外，体外实验显示 甲基化RARβ2 分子比未甲基化RARβ2 更稳定，而且容易进入细胞引起更强的转化潜能[17]。 这一结果提示肿瘤抑癌基因甲基化DNA 分子可能在肿瘤转化过程中起关键作用。 100 3 cfsDNA 的研究现状 2004 年，Chou 等通过改进的毛细管电泳法首次发现了cfsDNA[18]，随后我们课题组建 立了cfsDNA 提取方法[7]，证实了cfsDNA 的存在。目前，关于cfsDNA 研究的报道较少， 集中于cfsDNA 一般特征及临床应用研究两个方面。 3.1 一般特征 105 cfsDNA 特征研究包括其浓度、分子量大小、细胞来源和存在形式四个方面。首先，Li 等通过紫外分光光度计检测生精功能正常成年男性cfsDNA 浓度，发现其平均浓度为1.34 ± 0.65μg/ mL，明显高于血浆、羊水和尿液[7]。Chou 等和Li 等均对cfsDNA 分子量进行研究， Chou 等通过50μl 精浆进行毛细血管电泳，发现其分子量在1-12kb 之间[18]；Li 等取0.5-2μg 的cfsDNA 进行琼脂糖凝胶电泳，发现cfsDNA 分子量为180bp-15kb[7]，比Chou 等发现的 110 分子量范围更广。出现这一差别可能与电泳方法及电泳时加入cfsDNA 含量的差异有关。 CfsDNA 分子量范围提示其可来自凋亡和坏死细胞。Chou 等分别对冻存六个月前、后精液 的cfsDNA 进行定量分析，发现cfsDNA 来源与精子无关，可能来自于生殖器官细胞的主动 分泌和被动释放[18]。Li 等比较生精功能正常受试者与非梗阻性无精子症患者精浆cfsDNA 浓度，进一步证实了cfsDNA 部分来自于睾丸凋亡的生精细胞[7]。另外，Li 等发现通过0.22μm 115 滤膜过滤的精浆其cfsDNA 浓度未出现明显变化，cfsDNA 体外37℃24h 内能稳定存在，推 测其可能以小于0.22μm 蛋白质或脂类分子复合物形式存在，防止被DNA 酶降解[7]。最近前 列腺小体中DNA 分子的发现证实了这一推测[6]。 3.2 cfsDNA 临床应用研究 Chou 等将25 例男性的精浆标本进行毛细血管电泳，然后将每份标本高分子量（12kb） 120 和低分子量（1kb）cfsDNA 含量与对应标本的精子参数进行相关性分析，发现低分子量 cfsDNA 含量与快速前向运动精子比例、正常形态精子比例及精子获能指数和曲线速率明显 正相关[18]。而这些精子参数反映精子质量和功能，推测低分子量cfsDNA 含量可能成为预测 精子质量的标记物，这一结论还有待大样本证实。cfsDNA 除了做为标记物外，还可用于男 原创学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
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