【摘要】 尽管大部分垂体腺瘤患者经手术、药物、放射治疗或者综合治疗后,肿瘤占位效应和(或)内分泌症状可得到控制或者完全治愈,但是仍有部分患者经上述治疗后无效,一些肿瘤甚至在手术或丫刀治疗后出现瘤体侵袭样快速增长、肿瘤细胞Ki67大于3%、p53呈强阳性等恶性倾向,并伴随肿瘤病灶中成纤维细胞及瘢痕组织的增多。这其中以无功能垂体腺瘤(nonfunctional pituitary adenoma, NFPA)最为常见,荟萃分析显示,12%-58%的NFPA患者存在复发现象,其次是GH腺瘤,约有2%-3%。由于复发的垂体腺瘤组织质地偏坚韧,并向鞍上、两侧海绵窦或鞍底侵润性生长,粘连周围重要血管、神经等组织严重,无论是经鼻-蝶窦入路还是常规开颅手术,肿瘤切除均较初发时更为困难；同时,临床上缺乏相应的药物。因此,此类复发纤维化垂体腺瘤(recurrent fibrous pituitary adenoma, RFPA)严重影响着患者的生活质量甚至寿命,研究RFPA肿瘤发生发展机制并探索相关治疗方法显得尤为重要和迫切。新近研究结果显示,除了肿瘤细胞基因组改变,肿瘤间质——即肿瘤细胞所处微环境的变化,对肿瘤的发生发展有着重要影响。肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是肿瘤微环境中的主要间质细胞,其表型与愈合伤口或慢性纤维化组织中的肌成纤维母细胞(myofibroblasts)相近相似；一些参与炎症的细胞因子,如TGFβ1,可趋化成纤维细胞向肿瘤病灶迁移并使其转化为激活态CAFs。而激活转化的CAFs其细胞因子表达谱会发生改变,一方面可重塑肿瘤微环境组织结构(如,FAP,MMP9等),另一方面,作用于邻近的肿瘤细胞(如,IL6,SDF-la等),使其增殖、侵袭／迁移等能力进一步增强,并刺激肿瘤血管网的构建或介导肿瘤化疗耐药。因此,对RFPA微环境中成纤维细胞进行研究必将有助于我们对RFPA肿瘤发生发展机制的认识,并为下一步探索相关治疗靶点奠定理论基础。综上所述,本研究以5对来自于同一病患的前后两次肿瘤石蜡组织标本和22例初发垂体腺瘤(PPA)及12例复发纤维化垂体腺瘤(RFPA)新鲜标本为组织平台,以原代人垂体腺瘤(PACs)和垂体腺瘤相关成纤维细胞(pituitary adenoma-associated fibroblasts, PAFs)及鼠源垂体腺瘤和成纤维细胞细胞系为细胞平台,以荷瘤裸鼠为动物平台,在激光显微切割等实验技术辅助下,首先观察发现在RFPA组织中,垂体腺瘤细胞分泌TGFβ1增加,通过TGFβ1/Smad信号通路激活PAFs并使其分泌大量的collagen Ⅰ和Ⅲ,激活的PAFs通过TGFβ1/SDF-1α反应袢维持其肌成纤维母细胞样激活状态和促纤维化作用；另一方面,体外细胞和体内荷瘤裸鼠模型证实,激活的PAFs分泌SDF-1α增加,使PACs表面CXCR4受体表达增加并促进PACs的增殖、侵袭／迁移、激素分泌和体内成瘤能力,同时增加肿瘤干细胞比例；最后,通过体外14例人原代NFPA细胞SDF-1α刺激实验,发现SDF-1α作用后,NFPA细胞中miR-134和miR-370的表达水平显著下调,下游靶基因编码蛋白VFGFA和HMGA2的表达水平明显上升,推测SDF-1α可能通过影响肿瘤细胞1miRNAs转录,间接调控肿瘤相关蛋白表达,进而促进NFPA细胞增殖、侵袭等能力。本研究结果提示成纤维细胞与垂体腺瘤细胞可通过TGFβ1/Smad-SDF-1α/CXCR4信号通路相互作用,调控下游相关分子表达,增强并维持各自细胞活性和功能。这一作用机制可能在RFPA发生发展中起重要作用,阻断这一正反馈作用链可望成为治疗RFPA的新方法。第一部分PPA与RFPA中PAFs细胞表型及TGFβ1/Smad信号通路表达差异比较目的：明确在复发纤维化垂体腺瘤(RFPA)组织中激活态垂体腺瘤相关成纤维细胞(PAFs)的存在及其促纤维化能力；分析初发垂体腺瘤(PPA)和RFPA中垂体腺瘤细胞TGFβ1表达水平和成纤维细胞中TGFβ1/Smad信号通路相关蛋白表达水平之间是否存在差异。方法：收集来自于同一病人的首次PA及第二次RFPA石蜡标本5例(4例NFPA,1例GH)利用免疫组织化学方法配对分析两次手术病理标本中collagen Ⅰ、Ⅲ、 a-SMA和FAP差异表达情况,观察RFPA中TGFβ1/Smad相关蛋白在成纤维细胞中的表达情况；检测PPA和RFPA的肿瘤间质中TGFβ1的表达情况；另外收集22例PPA及12例RFPA新鲜标本,显微切割技术辅助下利用qRT-PCR、免疫组织化学等实验方法分别检测分析两类肿瘤细胞中TGFβ1以及相应PAFs中a-SMA、FAP、 COL1A1、COL1A2和COL3A1mRNA转录水平。结果：RFPA组织中存在大量a-SMA和FAP表达阳性的激活态成纤维细胞,此类成纤维细胞表达分泌的collagen I和Ⅲ明显高于其相应PPA组织中的collagenⅠ和Ⅲ,具有显著性差异(p<0.001)；且在RFPA中成纤维细胞TGFβRⅠ、TGFβRⅡ pSmad2和pSmad3均呈现强阳性表达；qRT-PCR结果显示,在RFPA组织中,成纤维细胞的a-SMA、FAP、COL1A1、 COL1A2和COL3A1mRNA表达水平和肿瘤细胞中TGFβ1的转录水平高于PPA组织垂体腺瘤细胞的表达水平(p<0.05)。结论：具有胶原分泌功能的激活态成纤维细胞在RFPA中大量存在；RFPAs组织中肿瘤细胞表达分泌TGFβ1增多,可能是邻近激活态成纤维细胞数量增多和活性增强的原因之一。第二部分TGFβ1/SDF-1α信号通路反应袢维持RPAFs肌成纤维母细胞样激活状态和促纤维化作用目的：探索RFPA组织中受TGFβ1/Smad信号通路激活的复发垂体腺瘤相关成纤维细胞(RPAFs)自分泌TGFβ1现象；分析TGFβ1/Smad信号通路对RPAFs细胞因子SDF-1α及其受体CXCR4表达影响；探索SDF-1α/CXCR4信号通路对RPAFs自分泌SDF-1α及TGFβ1的作用。方法：收集22例PPA及12例RFPA新鲜标本,部分进行体外原代细胞培养,获取相应PAFs (PPAFs和RPAFs),并分成相应实验和对照组,利用qRT-PCR、 ELISA等实验方法分析TGFβ1对肿瘤相关成纤维细胞TGFβ1/Smad信号通路激活和胶原分泌影响,同时分析TGFβ1对激活态RPAFs自身表达分泌TGFβ1和另一类细胞因子SDF-1α及其受体CXCR4的影响；部分标本进行显微切割获取各自组织中的成纤维细胞,利用qRT-PCR分析两组成纤维细胞中SDF-1α及其受体CXCR4表达差异；另将细胞培养所得成纤维细胞分成相应实验组对照组,利用qRT-PCR. ELISA等实验方法分析SDF-1α对激活态RPAFs自身表达分泌SDF-la和TGFβ1的影响；同时在鼠源垂体腺瘤细胞和成纤维细胞系水平,利用qRT-PCR. ELISA和western blot等方法对上述实验结果进行验证。结果：外源TGFβ1因子和肿瘤细胞CM可使成纤维细胞中CAF相关标志物和胶原的表达量明显升高(p<0.05)。qRT-PCR结果显示,RFPA组织中的成纤维细胞SDF-1α及其受体CXCR4的表达量明显高于PPA组织中成纤维细胞中两者的表达量(p<0.05)。体外人原代细胞及鼠源细胞系实验结果证实,外源性TGFβ1因子和SDF-1α因子均可使垂体腺瘤相关成纤维细胞自身的TGFβ1、 SDF-1α和CXCR4表达增强,且受相应受体抑制剂的抑制(p<0.05)。结论：RFPA组织中肿瘤细胞分泌的TGFβ1可激活成纤维细胞,并使其形成TGFβ1/SDF-1α反应袢。这一正反馈作用链是激活态成纤维细胞在RFPA组织中维持其生物学活性和人原代垂体腺瘤细胞培养后期培养基中成纤维细胞大量扩增及复发纤维化垂体腺瘤快速增长的可能原因之一。第三部分激活态成纤维细胞分泌SDF-1α对垂体腺瘤细胞增殖、侵袭／迁移、激素分泌、肿瘤干细胞比例及体内成瘤等能力的影响目的：分析PPA和RFPA组织中肿瘤细胞增殖、侵袭/迁移等相关蛋白标志物表达情况；探索由激活态成纤维细胞分泌的SDF-1α对鼠源垂体腺瘤细胞系增殖、侵袭/迁移、分泌激素、去分化形成肿瘤干细胞及体内成瘤细胞行为的影响,寻找RFPA肿瘤细胞恶性生物学倾向的可能分子机制和药物治疗靶点。方法：利用免疫组织化学、显微切割技术和qRT-PCR技术分析PPA和RFPA两类垂体腺瘤细胞中与增殖、侵袭/迁移、肿瘤干细胞表型相关蛋白标志物,以及SDF-1α/CXCR4表达差异情况。制备成纤维细胞条件培养基,通过aT3-1和GH3鼠源垂体腺瘤细胞系,利用CCK8细胞增殖活力检测法、FSH、LH和GH相应激素ELISA法、Transwell共培养小室侵袭实验、Live Cell Imaging System活细胞工作站及配套图像分析软件Improvision(?) Volocity、流式细胞术等技术以及构建裸鼠荷瘤模型,分析验证CAFs分泌的SDF-1α对肿瘤增殖、侵袭/迁移、激素分泌、去分化形成肿瘤干细胞等体外细胞学行为和相关蛋白表达的影响。结果：免疫组化结果显示,RFPA间质中SDF-la表达分泌水平及肿瘤细胞中与增殖、侵袭/迁移、肿瘤干细胞相关蛋白及CXCR4的表达水平明显高于PPA相应间质和肿瘤细胞中的表达量(p<0.05)；经重组SDF-1α细胞因子作用和激活态成纤维细胞条件培养基处理的肿瘤细胞其细胞增殖、侵袭/迁移、激素分泌、去分化形成肿瘤干细胞的能力明显强于其他实验组,相应的蛋白标志物表达增高(p<0.05)；同时,此两类处理组肿瘤细胞在裸鼠皮下形成的肿瘤体积明显大于其他各组(p<0.05),两组裸鼠外周血中的GH水平明显增高(p<0.05),免疫组织化学结果显示,相关的蛋白表达亦与其他各处理组间存在明显差异。结论：激活态成纤维细胞过度分泌的SDF-1α可使垂体腺瘤细胞的增殖、侵袭/迁移、激素分泌、去分化形成肿瘤干细胞和体内成瘤能力增强,其表达增强可能是临床RFPA发生发展的重要原因之一,阻断SDF-1α/CXCR4在垂体腺瘤细胞中的活性可能成为治疗RFPA的靶点之一。第四部分初探SDF-la对人原代NFPA细胞印迹基因簇DLK1-MEG3母源等位基因中相关microRNAs及其靶基因编码蛋白表达水平影响目的：分析SDF-1α对NFPA细胞中印迹基因簇DLK1-MEG3母源等位基因中与NFPA肿瘤发生可能相关1nicroRNAs (miRNAs)表达水平的影响,寻找SDF-la处理前后差异表达明显的1miRNAs,预测其下游靶基因和基因功能,为进一步探索发现SDF-la促进NFPA细胞增殖、侵袭／迁移等能力的分子机制提供理论基础。方法：临床选取14例初发非侵袭性NFPA标本进行原代细胞培养,纯化肿瘤细胞,将每一例肿瘤细胞分成对照组和SDF-1α作用组,利用qRT-PCR实验技术分析6类己报道和NFPA发生相关的DLKl-MEG3基因簇中的miRNAs (miR-134, miR-299-5p,miR-329,miR-370,miR-377-5p和miR-432)处理前后表达差异情况,统计学分析得出差异明显的miRNAs,利用miRBase寻找相应己被实验证实与肿瘤相关的下游靶基因,western blot验证靶基因编码蛋白表达差异是否具有统计学差异；将蛋白表达变化和相应miRNAs表达变化做相关性分析,最后通过石蜡组织标本做相应蛋白免疫组化染色。结果：14例NFPA肿瘤细胞经SDF-1α处理后,miR-134和miR-370表达量明显下调(p<0.01)；miRBase等搜索显示已经实验验证并与肿瘤相关的miR-134下游靶基因为：VEGFA和ABCC1;miR-370下游靶基因为：MAP3K8和HMGA2,其中VEGFA和HMGA2表达量明显上升(p<0.05),且VEGFA表达差异值与miR-134表达差异值存在负相关(R=-0.758,p<0.05)。免疫组织化学染色显示,复发垂体腺瘤组织中HMGA2和VEGFA表达明显增强。结论：SDF-la可能通过使NFPA细胞中miR-134和miR-370表达量下调,进而使下游HMGA2和VEGFA蛋白表达增强,促进肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成等能力。SDF-la-miR-134-VEGFA和SDF-1a-miR-370-HMGA2在垂体腺瘤细胞中的作用关系仍需要下一步在人及动物细胞系中的验证。未来,提高miR-134和miR-370在垂体腺瘤中的表达水平有可能成为治疗RFPAs的新方法。 
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