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低氧下三氧化二砷影响食管癌Eca109 细胞 放射敏感性的体外研究# 景绍武1，王雅棣2** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20091323110011） 作者简介：景绍武，（1982-），男，主治医师，胸部肿瘤的放射治疗。 通信联系人：王雅棣，（1963-），男，主任医师，恶性肿瘤的综合治疗。E-mail: wangyadi@hotmail.com 5 （1. 河北医科大学第四医院放疗科，石家庄 050011； 2. 北京军区总医院放疗科，北京 100700） 摘要：目的：观察三氧化二砷（As2O3）在低氧条件下，对食管癌Eca109 细胞增殖、细胞周 期及凋亡的影响，探讨其发挥放射增敏作用的可能机制。方法：CoCl2 模拟肿瘤低氧微环境， MTT 分别检测不同浓度As2O3 及不同剂量放射线对Eca109 细胞增殖的抑制作用；流式细胞 10 术检测低氧下As2O3、放射线及二者联合对细胞周期及凋亡的影响；Western blot 检测经 As2O3、放射线及二者联合作用后，Eca109 细胞中HIF-1α、p27 蛋白的表达情况。结果：在 常氧和低氧两种条件下，As2O3 均呈时间剂量依赖性地抑制Eca109 细胞增殖，相同时间， 相同浓度条件下，其抑制率无统计学差异（P>0.05），而放射线在低氧下对Eca109 细胞的 抑制作用较常氧下明显减弱（P<0.05）。低氧下，Eca109 细胞周期出现G0/G1 期阻滞，G2/M 15 期细胞比例明显减少，与常氧组比较，均有统计学差异（P<0.05）。As2O3 在低氧条件下可 诱导G2/M 期阻滞，G0/G1 期细胞比例减少。As2O3 与放射线联合应用，其凋亡率大于二者 单独作用之和。低氧条件下，HIF-1α、p27 蛋白表达均明显增强，As2O3 可逆转HIF-1α、p27 表达水平的升高。结论：低氧条件下，As2O3 对食管癌Eca109 细胞有放射增敏作用，可能 与下调HIF-1α，进而降低p27 表达水平，解除G0/G1 期细胞周期阻滞和诱导G2/M 期阻滞 20 有关。 关键词：低氧；三氧化二砷；食管肿瘤；细胞周期；放射敏感性 中图分类号：R735.1 Effect of arsenic trioxide on radiosensitivity of esophageal 25 carcinoma Eca109 cell line under hypoxia in vitro JING Shaowu1, WANG Yadi2 (1. Department of radiotherapy, the fourth hospital of Hebei medical university, ShiJiaZhuang 050011; 2. Department of radiotherapy, the Military General Hospital of Beijing PLA, Beijing 100700) 30 Abstract: OBJECTIVE: To investigate the effects of arsenic trioxide (As2O3) on cell proliferation, cell cycle and apoptosis under hypoxia, in order to explore its possible mechanism of radiosensitivity. METHODS: Cobalt chloride (CoCl2) was used to mimic hypoxic condition. After Eca109 cells were incubated with different concentration of As2O3 or different dose of radiation under normoxia or hypoxia, cell proliferation was determined by MTT assay. Cell cycle and 35 apoptosis were detected by flow cytometry (FCM) after cells were treated with As2O3, radiation or combined with each other under hypoxia. HIF-1α and p27 proteins were measured by Western blot. RESULTS: As2O3 inhibited proliferation in a concentration-and time-dependent manner under both normoxic and hypoxic conditions. No significant differences were noted in inhibited rate between normoxic and hypoxic conditions if time and concentrations were the same (P>0.05). 40 However, inhibition of radiation was weakened under hypoxia. Compared with those under normoxia, G0/G1 phase cell arrest appeared and proportion of G2/M decreased under hypoxia. As2O3 made cell arrest in G2/M phase and reduce G0/G1 proportion. Apoptosis in combined group was higher than the sum of those in As2O3 group and in radiation group. Under hypoxia, HIF-1α and p27 proteins enhanced, and As2O3 could suppressed their increasement. 45 CONCLUTION: As2O3 has radiosensitivity under hypoxia, possibly by down-regulating HIF-1α, which can inhibite p27 and then release G0/G1 phase arrest, and inducing G2/M phase arrest. Keywords: hypoxia; As2O3; esophageal carcinoma; cell cycle; radiosensitivity 0 引言 当肿瘤体积大于1 mm3 时，自身的血液供应就不能满足肿瘤细胞快速生长的需要，肿瘤 50 内部处在相对低氧的环境中[1]。低氧时，肿瘤细胞作出应激反应，许多基因的转录和表达发 生适应性改变[2]。HIF-1（hypoxia inducible factor-1, HIF-1）是低氧状态下存在于人体内的一 种异源二聚体核转录因子，由α和β两个亚单位组成，其中HIF-1α是唯一的氧调节亚单位。 作为调节肿瘤细胞适应低氧的核心转录因子，HIF-1α参与多种基因的转录调控，在肿瘤一 系列生物学行为的改变包括对放射治疗抗拒等方面扮演重要角色[3]。 55 我国是食管癌高发国家，且多数食管癌患者确诊时因期别较晚，失去手术机会，放射治 疗是其主要治疗手段之一[4]。但由于HIF-1α的过表达及对其下游因子的调控等不利因素的 存在，严重影响食管癌的放疗疗效[5]，放疗后局部肿瘤复发率较高[6]。研究发现，三氧化二 砷（arsenic trioxide, As2O3）在低氧下可下调HIF-1α表达，对急性早幼粒细胞生长有抑制作 用[7]，而我们前期的研究表明，As2O3 在常氧状态下对离体食管癌细胞株有放疗增敏作用[8]， 60 那么，As2O3 在低氧下是否对食管癌也有放疗增敏作用呢，目前还未见报道。为此，本实验 以化学低氧剂CoCl2 来模拟肿瘤低氧微环境，检测As2O3 和放射线在低氧下对食管癌Eca109 细胞株增殖、细胞周期及凋亡的影响，并进一步探讨其放射增敏机制，从而为临床应用提供 参考和理论依据。 1 材料与方法 65 1.1 材料 人食管癌细胞株Eca109 由我院科研中心提供。As2O3（1mg/ml）购自哈尔滨伊达药业 公司；RPMI Medium 1640 粉为Gibco BRL 公司产品；小牛血清为杭州四季青公司产品；兔 抗人HIF-1α单克隆抗体及兔抗人p27 单克隆抗体为Epitomics 公司产品。 1.2 方法 70 1.2.1 细胞常规培养 取对数生长期的人食管癌细胞株Eca109 接种于含10%小牛血清，青霉素100U/ml、链 霉素100ng/ml 的RPMI 1640 培养液中，置于37℃，5% CO2 培养箱内培养。 1.2.2 低氧培养 预先在常氧下培养，待细胞贴壁后，加入化学低氧剂CoCl2，使其终浓度为150μmol/L， 75 用于模拟肿瘤内低氧微环境[9]。 1.2.3 细胞照射 制备单细胞悬液，待细胞贴壁后，采用直线加速器6MVX 线室温下单次照射，剂量率 200cGy/min，面积20cm×20cm，源轴距100cm，机架角180°。 1.2.4 MTT 检测Eca109 细胞的增殖抑制率 80 实验分6 组：①As2O3-常氧组，将5×103 个细胞接种于96 孔板，待细胞融合至70%~80% 时加入As2O3，终浓度分别为0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L 和4.0μmol/L，培养24h、 48h 进行检测；②As2O3-低氧组，低氧培养24h 后，给予As2O3 处理，同①；③照射-常氧组， 待96 孔板中细胞融合至70%~80%时，采用剂量分别为2Gy、4Gy、8Gy 的放射线照射，培 养24h、48h；④照射-低氧组，低氧培养24h 后，给予放射线照射，同③；⑤对照-常氧组， 85 细胞在常氧下正常生长；⑥对照-低氧组，低氧培养，无其它干预。每组6 个复孔。以上6 组在检测前4h，各加入20μl MTT（5mg/ml），培养4h 后弃掉培养液，加入150μl 二甲基 亚砜，震荡10 min 后上酶标仪检测，检测波长492nm。细胞抑制率=（1－实验组吸光度值/ 对照组吸光度值）×100%。实验重复3 次。 1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 90 实验分5 组：①常氧-对照组；②低氧-对照组；③As2O3 组，低氧预处理24h，As2O3 浓 度选择2.0μmol/L，继续培养24h；④照射组，低氧预处理24h，放射线剂量选择4Gy，继 续培养24h；⑤As2O3＋照射组，低氧预处理24h，加入As2O3 2h 后照射细胞，继续培养24h。 各组细胞在-20℃用乙醇固定24h 以上，离心弃上清液后，加入200μl 碘化丙啶（PI）混合 液（含100mg/L 的PI，500mg/L 的RNase 酶），室温下避光培养30min 后检测。 95 1.2.6 流式细胞术检测凋亡 分组同上。将各组细胞消化后离心，用预冷的PBS 液洗涤2 次，用300 目滤膜过滤细 胞后，取100μl 细胞悬液，加5μl Annexin V，2.5μl PI 溶液，混匀后冰浴下暗盒内培养 10min，加150μl buffer 液后进行检测。 1.2.7 Western blot 检测HIF-1α、p27 表达 100 以上各组细胞加入适量的细胞裂解液收集细胞总蛋白。按照考马斯亮蓝试剂盒使用说明 进行蛋白浓度检测。每孔60μg 蛋白，加入10μl 的4×上样缓冲液中煮沸5min 后，用10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后通过转膜将蛋白转移至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入HIF-1α一抗（1:200 稀释），p27 一抗（1:200 稀释）， 和鼠抗人GAPDH（1:300 稀释），4℃过夜，分别加入HRP 标记的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG 105 （1:500 稀释），37℃孵育1h。采用ECL 检测，Gel pro4.0 凝胶成像系统分析条带灰度值， 以目的条带与GAPDH 条带的比值代表目的蛋白的相对表达水平。 1.3 统计学方法 采用SPSS11.5 统计学软件进行分析。计量资料用x ±s 表示，多组间比较采用单因素 方差分析。以P<0.05 判定为有统计学意义。 110 2 结果 2.1 常氧和低氧下As2O3 及放射线对Eca109 细胞增殖的抑制作用 不同浓度的As2O3 在常氧和低氧两种条件下，均呈时间浓度依赖性地抑制Eca109 细胞 的增殖，随时间的延长，浓度的增加，抑制率不断升高（P<0.05）。相同作用时间、相同浓 度，抑制率在常氧和低氧条件下，差异无统计学意义（P>0.05）。不同剂量放射线在常氧下， 115 呈时间剂量依赖性地抑制Eca109 细胞的增殖。但在低氧下，2Gy 的放射线在低氧处理48h 后对Eca109 细胞的增殖抑制率反较24h 时降低，出现加速增殖。相同作用时间、相同照射 剂量，抑制率在低氧下明显低于常氧，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。 表1 常氧和低氧下As2O3 及放射线对Eca109 细胞增殖的抑制作用（ x ±s，%） 24h 48h 组别 常氧 低氧 常氧 低氧 1.31±0.24 1.58±0.20 1.26±0.17 1.62±0.25 4.05±0.33 5.12±0.29 7.52±0.42* 9.38±0.77* 6.36±0.54# 7.55±1.04# 11.73±0.85*# 13.92±1.43*# 10.26±1.71# 13.11±1.62# 24.64±2.15*# 20.57±2.18*# 17.25±1.23# 18.72±2.24# 31.88±2.07*# 34.15±2.58*# 3.79±0.26 2.10±0.21& 5.65±0.14* 1.83±0.11& 7.22±0.85# 4.37±0.51#& 16.96±1.66*# 8.79±0.82*#& 对照组 0,5μmol/L 1.0μmol/L 2.0μmol/L 4.0μmol/L 2Gy 4Gy 8Gy 16.58±0.49# 10.04±1.32#& 33.13±1.06*# 18.55±2.1*#& 注：*P<0.05 与同样条件下24h 组比较；#P<0.05 与前一浓度As2O3 或前一剂量照射组比较；&P<0.05 与同 原创学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
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