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低氧对食管癌Eca109 细胞体外迁移及侵袭 的影响# 景绍武1，王雅棣2** 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20091323110011） 作者简介：景绍武，（1982-），男，主治医师，胸部肿瘤的放射治疗。 通信联系人：王雅棣，（1963-），女，主任医师，恶性肿瘤的综合治疗。E-mail: wangyadi@hotmail.com 5 （1. 河北医科大学第四医院放疗科，石家庄 050011； 2. 北京军区总医院放疗科，北京 100700） 摘要：目的 探讨低氧对食管癌迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法 采用CoCl2 化学低氧法模拟肿瘤低氧微环境，半定量RT-PCR 和免疫细胞化学分别检测不同低氧时相时 食管癌Eca109 细胞中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、E-钙黏蛋白及基质金属蛋白酶-2（MMP-2） 10 mRNA 及蛋白的表达。Western 印迹法检测雷帕霉素联合低氧处理Eca109 细胞后，HIF-1α、 E-钙黏蛋白及MMP-2 的变化。细胞划痕试验和Transwell 实验检测雷帕霉素联合低氧对 Eca109 细胞迁移及侵袭能力的影响。结果 Eca109 细胞在低氧状态下，HIF-1αmRNA 无明 显变化，仅蛋白表达增多；E-钙黏蛋白的mRNA 表达明显降低（P<0.05），蛋白表达减少； MMP-2 mRNA 表达明显升高（P<0.05），蛋白表达增多。雷帕霉素在低氧状态下可显著抑 15 制HIF-1α 及MMP-2 表达，促进E-钙黏蛋白高表达。经雷帕霉素处理后，Eca109 细胞在低 氧状态下，迁移速度减慢，侵袭穿膜细胞数减少（P<0.05）。结论 低氧使Eca109 细胞中 HIF-1α 蛋白表达增多，后者可能通过下调E-钙黏蛋白、上调MMP-2 表达促进食管癌在低氧 状态下的迁移及侵袭。 关键词：低氧诱导因子-1α；食管肿瘤；上皮型钙黏蛋白；基质金属蛋白酶-2 20 中图分类号：R735.1 Effects of Hypoxia on migration and invasion of esophageal carcinoma Eca109 cells in vitro JING Shaowu1, WANG Yadi2 25 (1. Dept of Radiation Oncology, Fourth Hospital of HeBei Medical University, ShiJiaZhuang 050011; 2. Department of radiotherapy, The Military General Hospital of Beijing PLA, Beijing 100700) Abstract: Objective To explore the effect of hypoxia on migration and invasion of esophageal carcinoma and its mechanism. Methods CoCl2 was used as chemical hypoxia-inducing reagent to 30 mimic tumor hypoxic microenvironment. mRNA and protein levels of HIF-1α, E-cadherin and MMP-2 at different hypoxic culture phases were detected by semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemistrym, respectively. After being treated with rapamycin combined with hypoxia, the protein expression of HIF-1α, E-cadherin and MMP-2 were assayed by western blot. The effect of rapamycin combined with hypoxia on migration and invasion were tested by cell scratch 35 assay and transwell chambers. Results Under hypoxia, mRNA level of HIF-1α had no significant change, while its protein level increased obviously; mRNA and protein levels of E-cadherin were down-regulated, but the mRNA and protein levels of MMP-2 were up- regulated. Under hypoxia, rapamycin inhibited the expression of HIF-1αand MMP-2, but E-cadherin was up-regulated. The migration and the number of invading cells decreased (P<0.05) after the treatment of rapamycin 40 under hypoxia. Conclusion Hypoxia can increase protein level of HIF-1α in esophageal carcinoma, which promote migration and invasion possibly through down-regulating E-cadherin and up-regulating MMP-2. Keywords: hypoxia inducible factor-1α; esophageal carcinoma; E-cadherin; MMP-2 45 0 引言 当肿瘤体积大于1mm3 时，自身的血液供应就不能满足肿瘤细胞快速生长的需要，使其 内部处于相对低氧的环境中[1]。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）作为调节肿瘤细胞适应低氧的 核心转录因子，参与多种基因的转录调控，在肿瘤的血管形成、能量代谢、侵袭转移等方面 扮演重要角色[2]。E-钙黏蛋白是最重要的细胞间黏附分子之一，与肿瘤的迁移及侵袭密切相 50 关[3]，其低表达可促进肿瘤细胞的淋巴转移[4]。此外，肿瘤细胞尚需产生和诱导某些蛋白酶， 通过降解细胞外基质（ECM）和基底膜来穿越组织屏障向周围侵袭和转移[5]。基质金属蛋白 酶-2（MMP-2）是一种能降解Ⅳ型胶原等多种ECM 成分的蛋白水解酶，在肿瘤侵袭转移中 发挥重要作用[6]。有研究显示HIF-1α可通过下调E-钙黏蛋白[7]、上调MMP-2[8]表达参与肿 瘤的侵袭转移，但在食管癌方面还未见报道。食管癌是华北地区高发病，本研究选用食管癌 55 细胞Eca109 为研究对象，通过体外模拟肿瘤低氧微环境，观察低氧状态下HIF-1α、E-钙 黏蛋白及MMP-2 的表达，并采用哺乳动物雷帕霉素靶向（mTOR）通道阻断剂—rapamycin （雷帕霉素）进行干预，检测食管癌Eca109 细胞体外迁移及侵袭能力的变化，探讨低氧在 食管癌迁移及侵袭中的作用及机制。 1 材料与方法 60 1.1 材料 人食管癌Eca109 细胞系由河北医科大学第四医院科研中心提供。兔抗人HIF-1α单克 隆抗体、兔抗人E-钙黏蛋白单克隆抗体和兔抗人MMP-2 多克隆抗体（Epitomics 公司）； TRIzol 试剂（Invitrogen 公司）；RT-PCR 试剂盒（Fermentas 公司）；Transwell 小室（Corning 公司）；Matrigel（BD 公司）；RPMI Medium 1640 粉（Gibco BRL 公司）；小牛血清（杭 65 州四季青公司）；雷帕霉素（Sigma 公司）。 1.2 方法 1.2.1 细胞体外低氧条件的建立 Eca109 细胞于含10%小牛血清的RPMI 1640 培养基（37℃、5%CO2 孵箱）中培养。化 学低氧剂CoCl2 加入培养基中，使其终浓度为150μmol/L，用于模拟肿瘤内部低氧微环境， 70 已进行了浓度梯度预实验。 1.2.2 半定量RT-PCR 检测HIF-1α、E-钙黏蛋白及MM P-2 mRNA 表达 细胞分4 组：常氧组、低氧6、12、24h 组。Trizol 法提取细胞总RNA，具体方法参照 试剂说明书。所有引物（表1）委托上海捷瑞生物工程有限公司设计并合成。反转录反应体 系（20μL）组成为：DEPC 水7μL，5×buffer4μL，dNTPs（10nM）2μL，Oligo(dT)1μ 75 L，RNase 抑制剂1μL，总RNA4μL，反转录酶1μL，37℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 10min。 PCR 反应条件：95℃预变性20s，（HIF-1α退火58℃ 20s；E-钙黏蛋白退火56℃ 20s；MMP-2 退火58℃ 20s；内参照GAPDH 退火57℃ 20s），72℃ 30s，共进行30 个循环；72℃延伸 10min。1.5 %琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物，Tanon 凝胶成像系统摄片并分析条带灰度值， 以目的条带与GAPDH 条带的比值代表目的基因mRNA 的相对表达水平。 80 表1 RT-PCR检测所用的引物序列 Tab.1 Primer sequences for RT-PCR gene primer sequences product size(bp) sense 5，-ACTCAGGACACAGATTTAGACTTG-HIF-1α 3， antisense 5，-TGGCATTAGCAGTAGGTTCTTG-3， 190 sense 5，-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3， E-cadherin antisense 5 ，-TGGCATTAGCAGTAGGTTCTTG-3， 136 sense 5，-TGACGGTAAGGACGGACTC-3， MMP-2 antisense 5，- ATACTTCACACGGACCACTTG-3， 124 sense 5，-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3， GAPDH antisense 5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3， 247 85 1.2.3 免疫细胞化学（SP 法）检测低氧状态下HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 蛋白表 达 收获常氧及低氧处理24h 后细胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，按照试剂盒说明书进 行免疫细胞化学染色。 90 1.2.4 雷帕霉素处理细胞 细胞分4 组，常氧组、常氧-雷帕组、低氧组和低氧-雷帕组。其中低氧-雷帕组为用含有 CoCl2 的培养基培养Eca109 细胞24h，结束前3h 加入浓度为100nmol/L 的雷帕霉素，使用 浓度及处理时间参照文献[9]。 1.2.5 Western 印迹检测HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 表达 95 用全细胞裂解液裂解细胞，提取上述4 组细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白质的含量并调 整浓度为2μg/μL。取各组60μg 蛋白，加入10μL 的4×上样缓冲液中煮沸5min 后，用 10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后通过转膜将蛋白转移 至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入相应的一抗4℃过夜，用TTBS 缓冲液洗3 遍× 5min 后，分别加入HRP 标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。采用ECL 检测，Gel pro4.0 100 凝胶成像系统分析条带灰度值，以目的条带与GAPDH 条带的比值代表目的蛋白的相对表达 水平。 1.2.6 细胞划痕试验测定细胞迁移能力 分组同1.2.4。取对数生长期细胞，按1×105 个/mL 接种于6 孔培养板培养至细胞完全 饱和。用无菌的200μL 的枪头垂直划出一无细胞的细痕，用PBS 小心清洗3 遍，去除漂浮 105 细胞，放入37℃、5%CO2 培养箱培养24h，4%多聚甲醛固定后显微镜下观察。 1.2.7 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 分组同上。聚碳酸脂微孔滤膜上铺Matrigel 凝胶（8.4mg/mL）50μL，4 组均以无血清 培养基制成1×105 个细胞/mL 的细胞悬液；各取200μL 移入小室，小室外各加入500μL 完全培养基；培养24h 后，用棉签刮除滤膜上室面的细胞，侵袭并粘附至下室面的细胞以 110 4%多聚甲醛固定，常规HE 染色。每张膜中央部分和周围部分各随机取5 个视野（×200 倍）。 计数每个视野内穿过8μm 微孔的细胞数，以每个视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。 1.3 统计学分析 所有实验均设3 份平行实验，结果以均数±标准差（ x ± s ）表示。采用SPSS11.5 软件 进行统计，两组数据比较采用成组均数t 检验，多组数据比较采用单因素方差分析。 115 2 结果 2.1 低氧状态下HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 mRNA 的表达 HIF-1αmRNA 在常氧状态下可见表达，在低氧6h、12h、24h 后，其表达无变化；E- 钙黏蛋白mRNA 随低氧时间的延长，其表达水平逐次降低。而MMP-2 随低氧时间延长，其 mRNA 表达逐渐升高（图1）。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 HIF-1α E-cadherin MMP-2 relative ratio normoxia hypoxia for 6h hypoxia for 12h hypoxia for 24h 120 *P<0.05 compared with normoxia group; #P<0.05 compared with other two hypoxia groups 图1 低氧状态下HIF-1α、E-cadherin 及MMP-2 mRNA 的表达 Fig.1 Expressions of HIF-1α, E-cadherin and MMP-2 mRNA under hypoxia 125 2.2 低氧状态下HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 蛋白的表达 常氧状态下，HIF-1α蛋白在Eca109 细胞中不表达；E-钙黏蛋白及MMP-2 在细胞质中 均较强表达。低氧24h 后，HIF-1α蛋白表达明显增强，细胞核和胞质中可见强阳性的棕黄 色颗粒；E-钙黏蛋白表达强度则减弱，而MMP-2 表达更 加增强，棕黄色颗粒增多，颜色 加深（图2）。 *# *# *# *# *# *# 130 A. expression of HIF-1α under normoxia; B. expression of HIF-1α under hypoxia; 原创学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
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