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C. expression of E-cadherin under normoxia; D. expression of E-cadherin under hypoxia; E. expression of MMP-2 under normoxia; F. expression of MMP-2 under hypoxia 图2 低氧状态下HIF-1α、E-cadherin 及MMP-2 蛋白的表达 135 Fig. 2 Expression of HIF-1α, E-cadherin and MMP-2 under hypoxia (×200) 2.3 雷帕霉素对HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 蛋白表达的影响 低氧可诱导Eca109 细胞表达HIF-1α蛋白，经雷帕霉素处理后，HIF-1α蛋白表达又被 显著抑制。E-钙黏蛋白在低氧状态下表达明显低于常氧状态，雷帕霉素作用后，其表达又复 140 升高。MMP-2 在低氧状态下表达显著强于常氧状态，雷帕霉素可抑制MMP-2 的升高。此3 种蛋白在常氧条件下均不受雷帕霉素影响（图3）。 *P<0.05 compared with normoxia; #P<0.05 compared with rapamycin-untreated under normoxia or hypoxia 图3 雷帕霉素对HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 蛋白表达的影响 Fig.3 Effects of rapamycin on expressions of 145 HIF-1α, E-cadherin and MMP-2 2.4 HIF-1α、E-钙黏蛋白及MMP-2 3 者的关系 经相关分析，E-钙黏蛋白表达与HIF-1α呈负相关（r =-0.834，P<0.05）。MMP-2 表达 与HIF-1α呈正相关（r=1.000，P<0.01）。E-钙黏蛋白表达与MMP-2 呈负相关（r =-0.840， 150 P<0.05）。 2.5 雷帕霉素对Eca109 细胞迁移能力的影响 Eca109 细胞的迁移速度由快至慢为：低氧组（图4C）>低氧-雷帕组（图4D）>常氧- 雷帕组（图4B）>常氧组（图4A）。 A. normoxia; B. normoxia-rapamycin; C. 155 hypoxia; D. hypoxia-rapamycin 图4 雷帕霉素对Eca109 细胞迁移能力的影响 Fig.4 Effects of rapamycin on migration of Eca109 cell (×200) 2.6 雷帕霉素对Eca109 细胞侵袭能力的影响 160 低氧组侵袭穿膜细胞数为134.6±16.3，显著高于低氧-雷帕组的96.0±11.4。常氧组侵 袭穿膜细胞数为69.2±13.2，常氧-雷帕组为63.7±10.5（图5）。 A. normoxia; B. normoxia-rapamycin; C. hypoxia; D. hypoxia-rapamycin 图5 雷帕霉素对Eca109 细胞侵袭能力的影响 165 Fig.5 Effects of rapamycin on invasion of Eca109 cell (×200) 3 讨论 HIF-1 是低氧状态下存在于人体内的一种异源二聚体核转录因子，由α和β两个亚单位 组成。其中HIF-1α是唯一的氧调节亚单位。目前，低氧在哪个水平上影响HIF-1α表达仍 170 有争议。本研究显示Eca109 细胞中HIF-1αmRNA 在常氧或低氧状态下表达无变化 （P>0.05），而HIF-1α蛋白虽在常氧状态下不表达，但在低氧时表达明显增强，支持低氧 在蛋白水平对HIF-1α进行调控的观点[10]。 E-钙黏蛋白是细胞间黏附分子的重要成员之一，有研究表明低氧时HIF-1α可通过下调 E-钙黏蛋白的表达，导致卵巢癌发生侵袭和转移[11]，MMP-2 作为MMPs 家族中分布最广的 175 一种蛋白水解酶，与肿瘤侵袭转移最为密切[12]，但在食管癌方面还未见报道。本研究发现 在低氧状态下，Eca109 细胞中E-钙黏蛋白mRNA 表达显著降低（P<0.05），蛋白表达减弱。 而MMP-2 随低氧时间的延长，mRNA 表达显著升高（P<0.05），蛋白表达增强。为了验证 这2 种蛋白与HIF-1α的相关性，本实验应用既能抑制HIF-1α合成，又能增加其降解[11]的 雷帕霉素处理细胞，发现在低氧状态下HIF-1α表达较未处理组显著降低，说明雷帕霉素抑 180 制了HIF-1α蛋白在低氧状态下的表达。E-钙黏蛋白在低氧-雷帕组明显升高，MMP-2 则明 显降低，而在常氧条件下这2 种蛋白均不受雷帕霉素影响，说明HIF-1α是抑制E-钙黏蛋白 和促进MMP-2 生成的重要因素。经相关性分析，E-钙黏蛋白与HIF-1α呈负相关，MMP-2 与HIF-1α呈正相关。本实验通过细胞划痕试验检测了Eca109 细胞的迁移能力，结果显示 低氧状态下Eca109 细胞迁移能力增强，但经雷帕霉素处理后其能力降低。Transwell 实验显 185 示低氧状态下细胞穿膜细胞数较常氧下明显增多（P<0.05），但经雷帕霉素处理后穿膜细胞 数减少，侵袭能力减弱。以上结果表明HIF-1α有可能是通过下调E-钙黏蛋白、上调MMP-2 表达来促进食管癌在低氧状态下的迁移及侵袭的。 HIF-1α作为低氧反应调控的中间因子，在促进食管癌迁移及侵袭转移方面发挥着重要 作用。但体外实验毕竟不同于体内，为此，下一步拟采用RNA 干扰技术封闭食管癌细胞 190 HIF-1α的表达，通过建立移植瘤动物模型，检测以上结论在动物体内是否也成立，为寻找 新的肿瘤治疗靶点提供进一步的实验依据。 [参考文献] (References) [1] Dewhirst MW, Cao Y, Moeller B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy 195 response[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(6):425-437. [2] Ellis L, Hammers H, Pili R. Targeting tumor angiogenesis with histone deacetylase inhibitors [J]. Cancer Lett, 2009, 280(2):145-153. [3] Koksal IT, Ozcan F, Kilicaslan I, et al. Expression of E-cadherin in prostate cancer in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: correlation with pathological features[J]. Pathology, 2002, 34(3):233-238. 200 [4] 刘青，王雅棣，董稚明，等. 锰超氧化物歧化酶和E-钙黏蛋白在鼻咽癌组织中的表达及意义[J].中华放 射肿瘤学杂志, 2009, 18(1)：37-41. [5] Poincloux R, Lizárraga F, Chavrier P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia[J]. J Cell Sci, 2009, 122(Pt17): 3015-3024. [6] Kenny HA, Lengyel E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis[J]. Cell 205 Cycle, 2009, 8(5): 683-688. [7] 林爽，李力，易萍. 低氧对宫颈癌HeLa 细胞黏附及侵袭能力的影响. 第三军医大学学报[J], 2007, 29(18)： 1776-1778. [8] 谢涛，袁响林，于世英，等. RNA 干扰HIF-1α降低宫颈癌细胞基质金属蛋白酶-2 的表达[J]. 癌症, 2008, 27(6):600-605. 210 [9] 陈斌，顾蔚卿，倪健. 雷帕霉素联合低氧诱导肺腺癌A549 细胞凋亡及其分子机制[J]. 肿瘤, 2010，30(12)： 293-297. [10] Ait-Si-Ali S, Guasconi V, Harel-Bellan A. RNA interference and its possible use in cancer therapy[J]. Bull Cancer, 2004, 91(1):15-18. [11] Hudson CC, Liu M, Chiang GG, et al. Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha expression and function 215 by the mammalian target of rapamycin[J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(20):7004-7014. [12] Kenny HA, Lengyel E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis[J]. Cell Cycle, 2009, 8(5):683-688. 原创学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
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