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FLAG 标记的Kir2.3 通道 的构建、表达及其对Kir2.3 通道功能的 影响# 5 赵志英1，张哲2，刘丽1，张国红1* 基金项目：国家自然科学基金资助项目（No 30900267）；教育部高等学校博士点新教师基金资助项目（No 20091323120006）；河北省卫生厅医学重点指导项目（No 20090321） 作者简介：赵志英，（1975-），女，副教授，研究方向：离子通道药理学。E-mail: zzy-zhq@hotmail.com （1. 河北医科大学药理教研室，教育部血管与神经生物学重点实验室，河北省新药药理毒 理研究重点实验室，石家庄 050017； 2. 河北省人民医院，临床医学研究中心，河北省老年医学重点实验室，石家庄 050000） 摘要：目的：构建FLAG 标记的Kir2.3 通道蛋白，为进一步研究通道的生理功能和调节机 10 制奠定基础。方法：运用聚合酶链式反应（PCR）技术，将FLAG 标记短肽DNA 碱基序列 插入到Kir2.3 通道氨基末端，构建重组质粒DNA：FLAG-Kir2.3-pGEMHE，采用菌落PCR 方法挑取阳性克隆；表达于非洲爪蟾卵母细胞，验证加入标记后，是否影响Kir2.3 通道蛋 白的功能；进行免疫细胞化学实验，检测FLAG 标记短肽表达情况。结果：经测序验证， FLAG-Kir2.3-pGEMHE 重组质粒DNA 构建成功，没有碱基突变。FLAG 标记短肽没有影响 15 Kir2.3 通道功能, FLAG-Kir2.3-pGEMHE 成功表达于非洲爪蟾卵母细胞，双电极电压钳可以 记录到电流。免疫细胞化学实验证实FLAG 标记短肽表达。结论：成功构建重组质粒DNA， FLAG 标记短肽已与Kir2.3 通道蛋白成功融合并有效表达。 关键词：分子药理学；DNA 重组；Kir2.3；FLAG 中图分类号：R966 20 Construction of FLAG tagged Kir2.3 channel, its expression and functional study ZHAO Zhiying1, ZHANG Zhe2, LIU Li1, ZHANG Guohong1 (1. Dept of Pharmacology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017; 25 2. The Clinical Trial Center,Hebei Provincial Key Laboratory of Geriatrics,People’s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050000) Abstract: Objective: Flag tag will be inserted into the upstream of Kir2.3-pGEMHE DNA sequence, which will laid a basis for future research. Methods: The DNA base sequence corresponding to the amino acid sequence of Flag peptide was inserted into the N-terminal of 30 Kir2.3 by PCR. The recombinant plasmid DNA FLAG-Kir2.3-pGEMHE would be constructed. The correct clones were chosen by the method of colony PCR and sent for sequencing. Flag-Kir2.3 will be expressed in the Xenopus oocytes. Consequence of Flag tagging on the Kir2.3 channel protein function will be studied. Immunocytochemistry method will be applied to confirm that the Flag-Kir2.3 has expressed on the membrane of the Xenopus oocytes. Results: After 35 examination by sequencing, we were sure that the Flag tag had been inserted into the N-terminal of Kir2.3-pGEMHE. FLAG-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes successfully. Channel currents were recorded by TEVC. Immunocytochemistry experiments showed that the Flag tag was fused with Kir2.3 channel protein successfully. Conclusion: FLAG-Kir2.3-pGEMHE, is constructed by means of PCR successfully. Moreover, the Flag tagged protein has expressed 40 stably and Kir2.3 channel function is not affected. These results laid a basis for future research. Keywords: Molecular pharmacology; DNA Recombination; Kir2.3; FLAG 内向整流钾通道（Inwardly Rectifying K Channel, Kir）是在各种组织中广泛分布的一种 钾离子通道， Kir2.0 钾通道的特征就是具有很强的内向整流特性，通道的整流作用有利于 维持细胞的静息电位并参与复45 极化过程[1]。Kir2.3 是Kir2.0 家族中的重要一员，已知可以被 细胞内或细胞外的信号分子如Mg2+、多胺、H+、PKC 等所调控[2]。研究Kir2.3 的调控机制 对研究内向整流钾通道家族的调控机制有重要意义。FLAG 是通用抗原表位标记物之一， FLAG 标签已广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及蛋白相互作用等相关领域。本 实验将FLAG 标签连接于Kir2.3 的氨基末端，构建重组质粒DNA：FLAG-Kir2.3-pGEMHE， 50 为进一步研究Kir2.3 通道蛋白的生理功能和调节机制奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 Kir2.3 cDNA 克隆于质粒pGEMHE 中，pGEMHE 载体质粒DNA 由美国纽约大学西奈 山医学院(Mount Sinai Medical School)生理学系Diomedes Logothetis 教授惠赠。Anti-FLAG 55 M5 monoclonal antibody 购自美国Sigma 公司，PyrobestTM DNA Polymerase 购自日本Takara 公司。实验用非洲爪蟾（Xenopus laevis），购于中科院上海神经科学研究所。 1.2 方法 1.2.1 构建重组质粒DNA 设计引物，将FLAG 标记短肽（DYKDDDDK）插入到Kir2.3- pGEMHE 的DNA 碱基序列氨基末端，同时加入酶切位点EcoRI 及保护性碱基，设计引物如 60 下： 上游引物（ 50 bp ） 5’AGGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGAC AAGATGCACGGACACAGC 3’；下游引物（24 bp）5’ACCAGATCAAGCTTGCTCTAGAGA 3’。采用高保真DNA 聚合酶进行PCR 反应，PCR 回收产物及载体pGEMHE 质粒DNA 同 时进行EcoRI 酶切，载体去磷酸化，连接产物转化后，采用菌落PCR 筛选阳性克隆，菌落 PCR 引物如下：上游引物（24 bp）5’ TCTTCTCCGCGGCCTTCCTTGTCT 3’，下游引物（24 65 bp）5’ CGGGCAGCACGGTGATCTTACTCT 3’。用BamHI 鉴别插入片段方向是否正确。经 测序选取无碱基突变的克隆。 1.2.2 重组FLAG-Kir2.3 通道蛋白表达于非洲爪蟾卵母细胞，将重组质粒DNA 和 Kir2.3-pGEMHE质粒DNA同时用限制性核酸内切酶NheI线性化，用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit 试剂盒进行体外转录得到它们的cRNA。分离爪蟾卵 70 母细胞，胶原酶消化为单个细胞后用ND96 清洗细胞。将FLAG-Kir2.3 和Kir2.3 cRNA 分别 注入爪蟾卵母细胞，18℃培养。双电极电压钳（two-microelectrode voltage clamp,TEVC）记 录电流是否表达。灌流液ND96（mM）：NaCl 96，KCl 1， MgCl2 1，CaCl2 1.8，HEPES 5， 用NaOH 调pH 为7.4；ND96K (mM)： KCl 96，NaCl 1， MgCl2 1，CaCl2 1.8，HEPES 5， 用KOH 调pH 为7.4。 75 1.2.3 免疫细胞化学实验将表达带有FLAG 标记短肽的Kir2.3 通道蛋白的爪蟾卵母细胞 与表达未带有FLAG 标记短肽的Kir2.3 通道蛋白的爪蟾卵母细胞同时进行4% 多聚甲醛固 定，PBS 清洗，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成切片，一组进行HE 染色，另一组进行免疫 细胞学实验，光镜下观察是否有阳性表达及其表达部位。 2 结果 80 2.1 构建重组质粒DNA Kir2.3 通道蛋白氨基末端（N 末端）在细胞内起始，两次跨膜折叠后羧基末端（C 末端） 在细胞内终止，N 末端较短，C 末端较长，且C 末端对通道在细胞膜的定位与信号传导有重 要作用[3]。所以我们选择在Kir2.3 通道N 末端添加FLAG 序列。以Kir2.3- pGEMHE 质粒 DNA 为模板DNA，经过PCR 反应，得到的产物片段长度与Kir2.3 的碱基数相似，大约为 85 2000bp，见Fig.1。PCR 扩增产物经测序结果证实为目的产物，非假阳性扩增。PCR 回收产 物及载体pGEMHE 质粒DNA 分别用EcoRI 酶切并纯化。因本次连接反应为同源粘末端连 接，为了最大程度减少载体自身连接反应，减少高背景假阳性克隆，载体必须进行去磷酸化。 进行菌落PCR 筛选阳性克隆[4]。在900 bp 处有条带为阳性克隆，无条带为阴性克隆，结果 见Fig.2，1、3、4、5、6、11、12、13 为阳性克隆。挑取其所对应的菌落，进行扩菌增菌， 90 提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶BamHI 鉴别插入片段方向是否正确。因为酶切位点 BamHI 在载体pGEMHE 和插入片段Kir2.3 的DNA 序列中都存在，酶切位点BamHI 在 pGEMHE 的DNA 序列第83 位，在酶切位点EcoRI 上方6 个碱基，Kir2.3 的DNA 碱基数为 1913，酶切位点BamHI 在其DNA 序列第1677 位，因此，若为正向连接，BamhI 酶切可得 两个片段3341 bp 和1594 bp，若为反向连接，BamhI 酶切可得两个片段4616 bp 和319 bp， 95 酶切结果见Fig.3，可见3、6、12 为正向连接。将连接正确的克隆进行测序，筛选无碱基突 变的克隆，至此重组质粒DNA 成功构建。 Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR products 100 Lane 1 negative control，Lane 2-6 PCR results. Fig.2 PCR screening of positive colony Lanes 1, 3, 4, 5, 6, 11, 12, 13 show positive bands with an expected size of 900bp. No positive bands were 105 found from colonies in lanes 2 ,7, 8, 9, 10. Lane 14 is a positive control and lane 15 is a negative control. The bands at the top of each lane are primer dimmers Fig.3 Orientation study of FLAG-110 Kir2.3 insert in pGEMHE Lane 2.3.4 represented the results of restriction digestion analysis from positive colons of 3,6,12, which indicated forward direction 2.2 在非洲爪蟾卵母细胞表达重组FLAG-Kir2.3 通道蛋白 115 将由重组质粒DNA和Kir2.3-pGEMHE质粒DNA转录而来的cRNA分别注入卵母细胞， 记录电流。PMA 为PKC 的激活剂，可以明显抑制Kir2.3 电流[5]。首先在高钾细胞外液 （ND96K）中，-80mV 到+80mV 的斜坡电压记录电流，Fig.4A 所示为Kir2.3 电流及给PMA 后电流-电压曲线变化图，Fig.4B 所示为重组通道电流及给PMA 后的相应电流-电压曲线变 化图，最后用ND96 外液冲洗以建立零电流基线（ND96 外液中，Kir2.3 在-80mV 电流很小）。 120 Fig.4C、D 为以上两种通道在给PMA 前后电流-时间变化结果。虚线为零电流，虚线下曲线 为钳制电压为-80mV 电流，虚线上曲线为钳制电压为+80mV 电流，结果显示0.5μM PMA 能 够明显抑制两种通道电流，抑制率分别为（46.3+5.2%， 44.8+6.1%），PMA 对两种通道的 抑制率经比较无显著性差异（P>0.05）（Fig.4E）。这说明FLAG 标记短肽未影响Kir2.3 通 道蛋白表达及其电流特性，为以后研究Kir2.3 通道蛋白的特性和调节机制奠定了基础。 E Fig.4 Effects of PMA on Kir2.3 currents and FLAG-Kir2.3 currents Kir2.3 channel and FLAG-Kir2.3 channel were expressed in Xenopus oocytes. A and B showed the I-V curves of Kir2.3 and FLAG-Kir2.3 currents before and after PMA application. C and D showed the 130 time course of Kir2.3 and FLAG-Kir2.3 currents before and after PMA application, respectively. Dotted lines indicate zero currents. E, Summery of inhibition of PMA on Kir2.3 and FLAG-Kir2.3 currents. * P>0.05, vs Kir2.3 currents, n=16. 2.3 免疫细胞化学实验 135 使用Anti-FLAG M5 monoclonal antibody，可以特异性与FLAG 肽段结合，再加入辣根 过氧化酶耦联的二抗，经免疫细胞化学染色，可见表达FLAG- Kir2.3 重组通道蛋白的爪蟾 卵母细胞细胞膜有棕黄色沉淀颗粒聚集，表达Kir2.3 通道蛋白的爪蟾卵母细胞细胞膜却未 见有特异性沉淀颗粒聚集（见Fig.5A 与Fig.5B）。由于Kir2.3 通道蛋白是膜蛋白[6]，所以 棕黄色沉淀颗粒聚集于细胞膜，证实了FLAG 标记短肽确实已与Kir2.3 通道蛋白成功融合 140 并稳定表达。 Fig.5 A Immunocytochemistry of Xenopus oocyte slices expressing FLAG-Kir2.3 (400×) 原创学术论文网Tag：代写论文 代发论文 代写代发医学 |
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